KROMATOGRAFI

Apa itu kromatografi? Di dalam pelajaran kimia, kita mengenal adanya istilah kromatografi. Kromatografi merupakan salah satu bagian dari teknik pemisahan komponen senyawa di dalam bidang kimia. Teknik pemisahan yang lain misalnya ekstraksi, destilasi dan sebagainya. Kromatografi sendiri adalah teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran yang ada di dalam sampel di antara dua fase, yakni fase diam (padat atau cair) dan fase gerak. Atau dapat juga diartikan sebagai suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan pada perbedaan pola pergerakan yakni antara fase gerak dan fase diam yang berguna untuk memisahkan komponen (molekul) yang berada di dalam sampel. Secara umum, teknik kromatografi terbagi ke dalam beberapa jenis yaitu, kromatografi gas dan kromatogarfi cair. Kromatografi cair terdiri dari beberapa macam yaitu, kromatografi kolom, kromatografi kertas (partisi), kromatografi absorbsi (lapis tipis).

Macam-macam kromatografi

Teknik pemisahan menggunakan metode kromatografi terdiri dari beberapa macam, berikut ini disajikan beberapa macam teknik kromatografi beserta penjelasannya:

1. Kromatografi kertas

            Kromatografi kertas menggunakan fase diam kertas, yakni kandungan selulosa di dalamnya, sedangkan untuk fase gerak yang digunakan adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kertas sebagai fase diam akan dicelupkan ke dalam sampel dan pelarut, selanjutnya sampel dan pelarut berdasarkan gaya kapilaritas akan terserap dan bergerak ke atas. Perbandingan jarak relatif antara senyawa (sampel) dengan jarak pelarut dihitung sebagai nilai Rf. Aplikasi penggunaan dari kromatografi kertas sendiri adalah untuk memisahkan diantaranya adalah tinta, zat pewarna, senyawa tumbuhan seperti klorofil , make up dan berbagai zat lainnya. Mekanisme kerja dari kromatografi kertas cukup sederhana, di laboratorium kita sering melakukan percobaan menggunaan teknik kromatografi kertas tersebut.

2. Kromatografi lapis tipis

            Kromatografi lapis tipis biasanya menggunakan sebuah lempengan tipis yang terbalut gel silika atau alumina. Silika atau alumina tersebut berfungsi sebagai fase diam. Materi lain juga bisa digunakan sebagai fase diam asalkan mampu mengalami pendarflour (fluorescence) dalam sinar ultra violet. Sementara untuk fase gerak yang digunakan adalah pelarut atau campuran pelarut yang digunakan. Aplikasi dari teknik pemisahan kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk mengetahui jenis pada campuran asam amino tertentu. Teman-teman mungkin bertanya, interaksi apa yang terjadi pada proses kromatografi cair sehingga terjadi pergerakan sampel di dalam pelarut? Ada beberapa interaksi yang terjadi, diantaranya adalah pembentukan ikatan hidrogen, ikatan vander walls dan gaya debye. Atau bisa juga berupa pembentukan senyawa kompleks.

3. GLC (Gas Liquid Chromatography)

GLC merupakan salah satu jenis kromatografi gas yang digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa organik yang mudah menguap. Pada kromatografi ini, fasa gerak yang digunakan adalah gas dan fasa diamnya adalah zat cair. Aplikasi dari kromatografi gas misalnya digunakan untuk menentukan komposisi kimia dari zat-zat yang tidak kita ketahui, seperti misalnya senyawa berbeda dalam bensin. Waktu analisa menggunakan GLC cenderung lebih lama. GLC menggunakan instrumen yang lebih kompleks, beberapa instrumen penting dalam GLC adalah sebagai berikut:

• Gas pembawa, merupakan gas yang harus inert dengan sampel dan harus murni. Diantara gas pembawa yang banyak digunakan adalah hidrogen, helium, nitrogen dan argon.
• Pengontrol aliran
• Injektor atau tempat untuk menyuntikkan sampel
• Kolom
• Detektor, merupakan instrumen yang berfungsi untuk merupakan sinyal analitik menjadi sinyal listrik.
• Rekorder, merupakan instrumen yang akan merubah sinyal listrik menjadi sinyal mekanik agar bisa dibaca dalam bentuk data.

4. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Teknik pemisahan HPLC memiliki banyak keunggulan dibanding dengan kromatografi lainnya, diantaranya adalah: cepat dalam proses analisa, resolusi yang lebih tinggi, sensitivitas detektor yang lebih tinggi, kolom yang dipakai dapat digunakan kembali, ideal dan cocok untuk zat bermolekul besar dan berionik dan mudah untuk rekoveri sampel. HPLC boleh dibilang sebagai teknik tercanggih dalam metode kromatografi. HPLC juga menggunakan sistem instrumen seperti pada kromatogarfi gas. Di dalam teknik ini juga digunakan tekanan dan kecepatan yang cukup tinggi sehingga mampu dihasilkan resolusi yang lebih baik.

ELISA

ELISA sebagai salah satu metode uji serologis mempunyai satu kelebihan yaitu mampu mendeteksi beberapa jenis antibodi dari 1 sampel serum (tergantung dari kit ELISA yang digunakan). ELISA juga memiliki tingkat spesifikasi (yaitu kemampuan mendeteksi ayam yang tidak terinfeksi atau ayam yang tidak terinfeksi dinyatakan negatif) yang tinggi.

Peralatan yang digunakan dalam uji serologis melalui ELISA salah satunya ialah microreader

Metode uji ini banyak digunakan untuk mendeteksi infeksi virus (IB atau IBD) maupun bakteri, seperti Salmonella sp. dan Pasteurella multocida. ELISA juga merupakan metode uji serologis yang cepat untuk menguji sampel dalam jumlah besar. Namun peralatannya, seperti reader, washer dan komputer relatif mahal.

ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label).

Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang menggunakan konjugat antigen–enzim atau konjugat antobodi–enzim, dan non-competitive assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai "Sandwich" ELISA.

Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan teknik "Sandwich" ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi:

1. Well dilapisi atau ditempeli antigen.
2. Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan.
3. Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu seperti peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya.
4. Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat bereaksi.
5. Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut ELISA reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off untuk menentukan hasil positif-negatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil negatif, dan demikian juga sebaliknya.

Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang besar terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen lain.^[2] Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi.^[3]

B. JENIS TES ELISA

           

1.      Indirect ELISA

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah:

a.       Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar  yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

b.      Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.  Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

c.       Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

d.      Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

e.       Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

f.       Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

g.      Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.

h.      Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.

2. Sandwich ELISA

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan  antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
9. Diukur absorbansinya  untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.

3. ELISA kompetitif

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu:

1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen
3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi
4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim
5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal,semakin lemah sinyal yang dihasilkan.

C. MEKANISME KERJA

DENSITOMETER, AUTOANALYZER, BLOOD GAS ANALYZER

  A. DENSITOMETER

Densitometer adalah alat yang didesign untuk mengukur denstitas optik. Densitometer bisa digunakan untuk mengukur densitas tinta printer atau densitas optic sebuah film.

Macam-macam Densitometer :

-Densitometer transmisi untuk mengukur objek transparan

Densitometer transmisi adalah sebuah cara untuk membaca sinar yang melewati objek transparan oleh sel fotoelektrik atau detector artinya sinar yang ditransmisikan melalui objek.
-Densitometer refleksion untuk mengukur densitas optic yang direfleksikan oleh cahaya.

Densitometri adalah sebuah cara untuk membaca sinar yang direfleksikan oleh permukaan objek oleh sel fotoelektrik atau detector

Komponen Densitometer :

Sumber cahaya yang stabil

Optik untuk memfokuskan sinar agar sinar jatuh tepat pada sampel

Penyaring untuk menentukan respon spectral unit

Detector untuk membaca sinar yang direfleksikan

Amplifier logarithmic

Layar display

Mekanisme Kerja

Sinari sampel  dari dari sudut 90⁰ dan pembacaan terlihat pada sudut 45⁰ dari permukaan sampel untuk menghindari efek glossy

Lalu hasil pembacaan refleksi terbaca oleh detector penyaring kemudian dikonversi menjadi suatu fungsi logaritma yang bisa diperbesar dan ditampilkan pada display.

B. BLOOD GAS ANALYZER

Yaitu alat yang digunakan untuk menentukan konsentrasi gas yang ada di dalam darah seperti CO2 dan O2, mengukur pH dan mengukur elektrolit seperti potasium, natrium, zat kapur serta klorid

Komponen Blood Gas Analyzer:

Ion Selective Electrode modules

Reagent chambers

Humidifier wells

Sample Input port

Peristaltic Pump

Waste module

Standard  Elektroda:

•      pH modules

Memproduksi berbagai tingkatan keluaran yang sebanding dengan pH sampel  yang sedang dianalisa

•       pCO2 modules

Memproduksi  voltase yang sebanding dengan konsentrasi  CO2  pada sampel.

•       pO2 modul

Menghasilkan  voltase yang sebanding dengan konsentrasi O2 pada  sampel.

•       Acuan Electroda

Menyediakan potensial elektrik yang konstan dan stabil (756mV) yang digunakan sebagai petunjuk untuk mengukur potensial elektrik yang diproduksi oleh setiap pengukuran elektroda.

•      Heater menjaga/mempertahankan  standar elektroda pada suhu 37⁰C

•       Sensor suhu Menunjukan temperatur ketika suhu turun atau naik 2 derajat di atas 37⁰C

•       Udara Alir detector Berada  di tempat masuk atau keluar dari standar elektrooda. Memeriksa adanya udara atau cairan di dalam tabung sampel.
      Sumber cahaya menghasilkan sinar yang akan melewati tubing ke fotodetektor.
            Fotodetektor dimonitor oleh uP yang memonitor detector udara/cairan jadi dapat mendeteksi pompa peristaltic ketika mulai atau berhenti.
      Tempat reagen standar dari dua larutan digunakan untuk mengkalibrasi pH eleektroda dan larutan pencuci.
      Ada dua larutan yang bisa digunakan untuk mengkalibrasi pH elektroda selama proses kalibrasi.
Larutan pencuci digunakan untuk mencuci sampel setelah dianalisis.

PELEMBAB UDARA

Digunakan untuk menjenuhkan gas yang akan digunakan untuk mengkalibrasi elektroda pO2 dan pCO2 dengan air.

TEMPAT SAMPEL

- Adalah tempat dimana sampel dimasukkan untuk dianalisis.

POMPA PERISTALTIK

-Masukkan reagen dan sampel melalui tubing ke dalam standar elektroda di luar botol pencuci.

-Cairan akan dihisap ke dalam analiser ketika tubing ditekan oleh pompa roller. Ini terjadi karena terjadi tekanan pada roler kepada tubing.

PEMBUANGAN

•      Kumpulkan limbah setelah analisis. Hal ini harus dilakukan secara rutin

Keterangan:

•      Tempat pembuangan berisi darah. Buang limbah di tempat sampah biohazaard. Jangan buang limbah pada tempat yang kering.


      C. AUTOANALYZER

 Autoanalyzer adalah alat yang memiliki presisi tinggi dan mudah digunakan dan digunakan untuk mengotomatisasi pemeriksaan kimia basah tradisional.

JENIS AUTOANALYZER

-CFA (Continuos Flow Analyzer)

-FIA (Flow Injection Analyzer)

CFA (Continuos Flow Analyzer)

-Prinsipnya, gelembung udara membawa sampel ke tiap ruangan pemeriksaan dalam mesin untuk kemudian dianalisa. Metode ini bisa ddipercaya untuk memeriksa 90 sampel per jam. Meskipun pada saat melewati batas kuota pemeriksaan per jam dapat meningkatkan cross contamination.

FIA (Flow Injection Analyzer)

-Prinsip kerjanya, tiap sampel dilarutkan dalam pelarut masing masing untuk kemudian dimasukkan kedalam mesin. Udara tidak mengambil peran dalam sistem ini. Bagian dari sampel dimasukkan kedalam ruang pemeriksaan untuk kemudian diperiksa. Meskipun sistem ini memilii berbagai macam keterbatasan namun sistem ini memberi jalan kepada produsen untuk memperkecil ukuran autoanalyzer.

KOMPONEN
 -Sampler
-Micropump
-Cartridge Base & Analytical Cartridge
-Docking Photometer base
-Digital Detector
-Data Acquisition system
-Surfactants

SAMPLER

-Memasukkan sampel pada reagen dari analytical cartridge secara otomatis menggunakan sebuah probe yang otomatis bergerak diantara sampel dan cairan pencuci dengan interval waktu yang tepat.  Sampel ditampung pada tabung atau sample cups.

MICROPUMP

-Memindahkan sampel dan reagen bersama kedalam anlalytical cartridge menggunakan gerak peristaltic yang dihasilkan oleh pump tersebut.

Cartridge Base & Analytical Cartridge

-Cartridge base adalah tempat untuk Analyticasl Cartridge. Fungsinya adalah untuk mengatur suhu dengan digital heat controller.

-Analytical Cartridge adalah cartridge yang diatur khusus yang digunakan untuk berbagai macam pemeriksaan

-Kedua instrumen ini memiliki:

      Glass mixing coils and fittings
Heath bath
Dialyzers
Phase separator
Flowcell

Docking Photometer Base

 - Instrumen ini menyediakan arus listrik DC yang teratur yang mampu menyuplai 3 buah fotometer dengan kebutuhan 305A. Instrumen ini menyediakan sumber cahaya kepada fotometer.

DIGITAL DETECTOR

 -Digital Detector mengukur absorbance dari produk berwarna yang dihasilkan oleh reaksi antara sampel dan reagen. Digital detector ini mengubah sinyal dari absorbance tersebut menjaddi sinyal elektronik digital.

 -Digital detector menggunakan wavelength filter dan flowcell yang mudah untuk diubah.

Data Acquisition system

 -Menyediakan hardware control dan “data reduction” dari 8 detector secara simultan. Ini merupakan aplikasi yang terintegrasi dengan windows.

SURFACTANT

      Menurunkan tegangan permukaan dari “flow stream” dam menurunkan tekanan balik dari analyzing cartridge. Ini membuat bubble injection dan fluid flow untuk mengalir secara lembut dan lancar.

OPERATION

  Sehari sebelum digunakan:

1.                   Pastikan cartridge yang akan digunakan benar untuk pemeriksaan yang akan digunakan. Periksa selang pada pump, pastikan kondisinya bagus.

2.                   Cek ketersedian reagen dan waktu kadaluarsa. Periksa juga Cartridge yang berisi reagen untuk metode khusus.

3.                   Buat Calibrants

4.                   Persiapkan sampel.

   Prosedur pengoperasian

1.                   Nyalakan power supply

2.                   Siapkan “startup/shutdown solution” dan isi cairan pencuci sampel

3.                   Kunci tempat pump. Nyalakan pump utama dan pump auxiliary

4.                   Pada komputer buka program Data Acquisition system

5.                   Setelah memompa startup solution selama 5-10 menit letakan tabung dengan chemwash pada posisi rak ke 20. Set timer 10 menit. Pada DAS pilih System > Clean System

6.                    Setelah 10 menit timer berhenti, cuci reagent straw dengan DI H2Olalu pompa kembali startup solution. Biarkan proses pencucian berlangsung selama 20 menit.

7.                    Pada DAS pilih configuration yang sesuai pada toolbar. Masukkan nama dari pemeriksaan klik OK

8.                    Pastikan reagen cukup

9.                    Setelah 20 menit proses pencucian, secara visual lihat adanya aliran yang baik. Pola gelembung pada mixing coil seharusnya seragam dan mengalir dengan lancar melewati cartridge

10.                Cek baseline signal dengan cara pilih Options>Display signal all kemudian pilih Options>zero signal all. Pastikan bahwa sinyal datar dan halus.

11.                Jika Baseline datar dan halus. Masukkan selang reagen ke botol yang tepat kemudian nyalakan heath bath.

12.                Masukkan smapel ID kedalam “Sample Tables”. Masukkan Calibrant yang sesuai pada tiap pemeriksaan.

13.               Ambil calibrant dari pendingin. Masukkan pada botol calibrant yang sesuai. Letakkan pada rak yang sesuai

14.                Masukkan kembali calibrant ke pendingin

15.                Pastikan jumpah Sampel ID pada tabel sesuai dengan jumlah sampel pada sampler

16.                Setelah baseline dan jumlah sampel sesuai klik Run-Begin pada DAS.

17.               Setelah calibrant selesai lihat hasil calibrant. Seharusnya nilai calibrant adalah 0.999 jika kurang dari 0.998 dipastikan ada yang salah. Ulangi kalibrasi, jika tidak berubah dianjurkan untuk membuat calibrant baru.

18.                Setelah Run selesai, matikan heath bath, kembalikan semua selang reagen ke startup/shutdown solution biarkan berjalan selama 10 menit. Twempatkan semua selang reagen ke CHEMWASH dan bersihkan selama 10 menit. Kembalikan semua selang reagen ke startup/shutdown solution biarkan berjalan selama 30 menit

19.                Clik Show Report untuk melihat hasil akhir pemeriksaan. Gunakan File>print untuk mencetak hasil atau File>Export untuk mengekspor kle file bentuk lain misal microsoft excel.

20.               Setelah 30 menit dan suhu dibawah 50 derajat celcius matikan pump. Lepaskan Pump Plattens.

21.               Tutup DAS. Matikan power supply.

22.                Matikan aliran air.

23.                Tutup Autoanalyzer agar bebas dari debu.